آموزش توليد و كشت آگار (بخش دوم)

كشت هاگ[xv][xv]

كشت خالص به منظور تهيه اسپان مورد نياز براي تكثير قارچ خوراكي را به دو روش مي‌توان تهيه نمود. كشت هاگ، كه به نوعي مي‌توان آن را تكثير جنسي ناميد و داراي تفريق صفات و تنوع بالاي نتاج حاصله از نظر كيفيت و كميت محصول مي‌باشد. از اين روش بيشتر براي تهيه بذر قارچاستفاده مي‌شود. روش دوم كشت بافت زنده^[xvi][xvi] يا به اصطلاح تكثير غيرجنسي^[xvii][xvii] و يا كلونينگ^{[xviii][xviii]} مي‌باشد. اين روش به علت شباهت بالاي نتاج توليدي با والدين؛ بيشتر در تكثير قارچ‌هائي كه از نظر كيفيت و كميت محصول در حد مطلوبي هستند استفاده مي‌شود.

پرورش دهندگان قارچ، كشت هاگ را بدليل راحتي اجرا و ماندگاري بالاي هاگ‌ها حتي تا ماهها بعد از تجزيه كلاهكها ترجيح مي‌دهند. اما ماندگاري كلاهكها يا بافت زنده بسيار كم است (1 تا 2 روز) و بايد بلافاصله بعد از چيدن بافت، اقدام به كشت نمود.

گرفتن نقش هاگ[xix][xix]

مرحله اول در كشت هاگ؛ جمع‌آوري مقداري هاگ (نقش اسپور) از قارچ‌هاي سالم و مناسب مي‌باشد. بدين منظور كلاهك سالم، تازه و كاملاً تميزي را از ساقه جدا نموده و بطور واژگون روي يك كاغذ سفيد يا سطح شيشه‌اي تميز (اسلايد ميكروسكوپ) يك تا دو ساعت مي‌گذاريم. چنان‌چه كلاهك موردنظر خشك باشد، جهت رهاسازي آسانتر هاگ يكي دو قطره آب مقطر به آن زده و براي جلوگيري از كاهش تبخير و جريان هواي مستقيم، يك بشر بر روي آن مي‌گذاريم. پس از چند ساعت كه هاگ‌ها، كاملاً رها شد و نقش تيغه‌ها روي كاغذ افتاد؛ كاغذ هاگ‌ها را بريده از وسط تا مي‌زنيم و دريك ظرف كاملاً در بسته گذاشته وروي آن را بر چسبي حاوي زمان جمع‌آوري؛ گونه قارچ و شماره جمع‌آوري مي‌زنيم. در صورت جمع‌آوري هاگ‌ها روي لامل ميكروسكوپ، كافيست هاگ‌ها را ما بين دو لامل قرار داده دور تا دور لبه اين دو لامل را با نوار چسب بچسبانيم تا از نفوذ هاگ‌هاي آلاينده، ايمن شود. در صورتي كه در جمع‌آوري و نگهداري هاگ‌ها دقت كافي نشود، محيط كشت هاگ آلوده شده و امكان به دست آوردن يك كشت خالص كاهش مي‌يابد.

Bunsen burner .[1][i] 

inoculating .[1][ii] 

glove box .[1][iii]

P.D.A= Potato Dextrose agar .[1][iv]

MEA= Malt Extract Agar .[1][v]

yeast .[1][vi]

(نوعي ماده آليوميني سهل الهضم)  Peptone  .[1][vii]

Neopeptone .[1][viii]

ويتامين ب كمپلكس  Thiamine  .[1][ix]

مخفف  Potato Dextrose Yeast .[1][x]

مخفف  Malt Peptone Grain .[1][xi]

1. توجه شود كه از مالتهاي تيره رنگ آبجو سازي استفاده نكنيد، بلكه بايد از مالتهاي روشن و عسلي و پودر مانند استفاده نماييد.

Pressure cooker .[1][xiii]

2 . معادل با.kg/cm2. 05/1..يا تقريباً.1 آتمسفر( atm)

Spore culture .[1][xv]

Tissue culture .[1][xvi]

A***ual propagation . [1][xvii]

clonning .[1][xviii]

Spore print .

چنانچه در حين تهيه محيط كشت، pH خيلي پائين يا بالا رود، مي‌توان بترتيب آن را با Naoh يا Hcl (1 تا 1/0 مولار) رقيق، تعديل كرده سپس محيط كشت را كاملاً هم زده و سپس pH آن را با يك pH سنج يا كاغذ تورنسل معمولي مي‌سنجيم ( pH يك مول Hcl ، صفر؛ يك مول Naoh =12 و يك مول آب مقطر= 7 است).

2.ضدعفوني محيط كشت: اين كار معمولاً به دو روش صورت مي‌گيرد.

الف: با مواد شيميائي: مانند الكل 70درصد؛ هيپوكلريت سديم (وايتكس) 1درصد و بالاخص آنتي‌بيوتيكها. در هر صورت ساده‌ترين راه، استفاده از مواد گياهي غير آلوده است. جهت كنترل باكتريها در محيط كشت، 1/0 گرم از محلول سولفات جنتامايسين 80-60درصد را قبل از عمل اتوكلاو كردن بايد به هر ليتر از اين محيط‌ها اضافه نمود. همچنين مي‌توان از نوع ديگر آنتي‌بيوتيك بنام استرپتومايسين بعد از استريل كردن محيط كشت استفاده كرد. در مجموع بايد از آنتي‌بيوتيكها بصورت موقتي و به مقدار بسيار اندك بهره جست چون غلظت بالاي آنها، مانع رشد و نمو بعضي گونه‌ها و از طرف ديگر ايجاد مقاومت در باكتريها مي‌شود.

ب) با بخار: بعد از اختلاط كامل تركيبات محيط كشت و در صورت باقي ماندن اثرات باكتري بعد از ضدعفونيِ شيميائي (آنتي‌بيوتيكها) مي‌توان براي رفع هر گونه آلودگي با بخار تحت فشار، محيط كشت را استريل و يا به اصطلاح اتوكلاو نمود. استريل كردن صحيح، بستگي به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استريل دارد. در شرايط عادي مي‌توان محيط كشت آماده را داخل ارلن پيركس (به علت دهانه تنگ آن ميزان تهويه، خشك شدن و ضريب آلودگي كاهش مي‌يابد) ريخته درب آن را با يك فويل آلومينيومي پوشاند. دقت كنيد كه حجم آگار درون ارلن نبايد از  تا  حجم كل ظرف بيشتر شود.

ظرف كشت را داخل اتوكلاو يا زودپز معمولي[xiii][xiii] قرار داده و ته زود‌پز را يك سانتي‌متر آب مقطر بريزيد تا بخار لازم تأمين شود. طبق دستورالعمل شركت سازنده، درب زودپز را كاملاً بسته آن را حرارت دهيد تا بخار فراوان توليد نمايد. قبل از بستن سوپاپ اطمينان بخار، بگذاريد تا بخار آن به مدت 4 تا 5 دقيقه خارج شود. به آرامي فشار را به 15 پوند[xiv][xiv] رسانده و 30 دقيقه در همين فشار نگهداريد. توجه كنيد دماي ظرف از 121 درجه سانتي گراد فراتر نرود، چه در غير اين صورت قند موجود در محيط كشت، سوخته و به اصطلاح كارامل مي‌شود كه در نتيجه آن؛ رشد ميسليوم متوقف شده، يكسري جهش‌هاي ناخواسته ژنتيكي پديدار مي‌شود. از طرفي اتوكلاو كردن بيش از 30 دقيقه باعث ته‌نشين شدن املاح مفيد (بخصوص k+ ) و تجزيه آگار مي‌شود. هم چنين بايد ظروف خالي شيشه‌اي و كاغذها را بطور جداگانه به مدت 30 دقيقه در دماي 130 سانتي‌گراد (بصورت خشك) استريل نمود.

نكته حائز اهميت ديگر در مورد اتوكلاو كردن، اين كه زمان لازم براي اين عمل بسته به ارتفاع از سطح دريا، متفاوت است. طبق قانون بويل ـ ماريوت؛ در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقيمي با يكديگر دارند. فشار هوا را معمولاً نسبت به سطح استاندارد دريا محاسبه ‌نموده و هر چه از سطح دريا بالاتر مي‌رويم فشار هوا كمتر مي‌شود. لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دريا، بايد فشار اتوكلاو يا زودپز را افزايش دهيم تا خللي در عمل استريليزاسيون وارد نشود. ذيلاً نسبت‌هاي بين پارامترهاي دما، فشار هوا، و تغييرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را در جدول ذيل مي‌بينيد. بعنوان مثال در ارتفاع حدوداً 1500 متري از سطح دريا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دريا تقريباً 5/4 -5 درجه سانتي‌گراد كاهش مي‌يابد (C˚95) و از طرفي در اين ارتفاع؛ فشار هوا 5 پوند يا تقريباً 4/0 اتمسفر نسبت به سطح دريا افزايش مي‌يابد (4/1 اتمسفر) در نتيجه با توجه با اين كه نبايد دماي داخل اتوكلاو را (به سبب بروز تغييرات شيميائي مواد داخل آن) افزايش دهيم، بناچار مجبوريم، فشار را به ميزان 4/0 آتمسفر (5 پوند) بالا ببريم تا جبران 5 اختلاف دما را در اين ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوكلاو بنمايد.

 

 

رابطه ارتفاع و نقطه جوش		رابطه فشار- دما در حجم ثابت
نقطه جوش	ارتفاع ازسطح دريا(متر)	فشارKg/cm2	(سانتي گراد) دما
100	در سطح دريا	07/0	100
99	307	2/0	104
98	619	3/0	108
97	5/934	7/0	115
96	1250	=1atm05/1	121
95	1567	5/1	126
93	1892	75/1	130

 

توجه كنيد استريليزاسيون در فشار 05/1 kg/cm² به مدت يك ساعت داراي نتايج مشابهي با استريليزاسيون در فشار kg/cm²2 به مدت 30 دقيقه (يعني دوبرابر كردن فشار و نصف كردن مدت زمان) دارد؛ منتها مسأله مهم در اين جا اين است كه اكثر زودپزها تحمل اين فشار را ندارند كه بايد حتماً قبل از استفاده به برچسب كنترل كيفي روي هر زودپز توجه شود.

بعد از اتمام استريل كردن؛ زودپز را در آزمايشگاه يا يك اطاق نيمه استريل قرار داده، اجازه دهيد تا قبل از باز كردن درب آن، فشار به يك پوند (07/0kg/cm²) كاهش يابد. سپس درب آن را باز نمائيد و اقدام به ريختن آگار در پتري ديش‌ها نمائيد. بايد دانست با هر ليتر از محلول آگار بدست آمده مي‌توان 30 پتري ديش 15×100 ميلي‌متر را پر نمود. چنانچه با محدوديت فضاي ميزكار مواجه هستيد، مي‌توانيد پتري ديش‌ها را پس از پر نمودن يك به يك روي هم بگذاريد اما در‌ غير اين صورت مي‌توانيد هر يك از پتري ديش‌ها را در كنار هم قرار دهيد و دامنه كار خود را توسعه دهيد .

 

پيش از پر نمودن پتري ديش‌ها، محلول كشت را به شدت تكان دهيد تا محتويات آن خوب پخش شده مخلوطي همگن بدست آيد. سپس بگذاريد تا آگار خنك شده و يكنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتري ديش‌ها نمائيد تا بدين وسيله از تعريق جدار داخلي ظروف كه از ريختن محلول آگار گرم ناشي مي‌شود، جلوگيري شود.

حال، اين محلول آماده كشت هاگ يا بافت زنده مي‌باشد كه در ادامه روش آنرا خواهيم ديد.

كشت هاگ[xv][xv]

كشت خالص به منظور تهيه اسپان مورد نياز براي تكثير قارچ خوراكي را به دو روش مي‌توان تهيه نمود. كشت هاگ، كه به نوعي مي‌توان آن را تكثير جنسي ناميد و داراي تفريق صفات و تنوع بالاي نتاج حاصله از نظر كيفيت و كميت محصول مي‌باشد. از اين روش بيشتر براي تهيه بذر قارچاستفاده مي‌شود. روش دوم كشت بافت زنده^[xvi][xvi] يا به اصطلاح تكثير غيرجنسي^[xvii][xvii] و يا كلونينگ^{[xviii][xviii]} مي‌باشد. اين روش به علت شباهت بالاي نتاج توليدي با والدين؛ بيشتر در تكثير قارچ‌هائي كه از نظر كيفيت و كميت محصول در حد مطلوبي هستند استفاده مي‌شود.

پرورش دهندگان قارچ، كشت هاگ را بدليل راحتي اجرا و ماندگاري بالاي هاگ‌ها حتي تا ماهها بعد از تجزيه كلاهكها ترجيح مي‌دهند. اما ماندگاري كلاهكها يا بافت زنده بسيار كم است (1 تا 2 روز) و بايد بلافاصله بعد از چيدن بافت، اقدام به كشت نمود.

گرفتن نقش هاگ[xix][xix]

مرحله اول در كشت هاگ؛ جمع‌آوري مقداري هاگ (نقش اسپور) از قارچ‌هاي سالم و مناسب مي‌باشد.پرورش قارچ بدين منظور كلاهك سالم، تازه و كاملاً تميزي را از ساقه جدا نموده و بطور واژگون روي يك كاغذ سفيد يا سطح شيشه‌اي تميز (اسلايد ميكروسكوپ) يك تا دو ساعت مي‌گذاريم. چنان‌چه كلاهك موردنظر خشك باشد، جهت رهاسازي آسانتر هاگ يكي دو قطره آب مقطر به آن زده و براي جلوگيري از كاهش تبخير و جريان هواي مستقيم، يك بشر بر روي آن مي‌گذاريم. پس از چند ساعت كه هاگ‌ها، كاملاً رها شد و نقش تيغه‌ها روي كاغذ افتاد؛ كاغذ هاگ‌ها را بريده از وسط تا مي‌زنيم و دريك ظرف كاملاً در بسته گذاشته وروي آن را بر چسبي حاوي زمان جمع‌آوري؛ گونه قارچ و شماره جمع‌آوري مي‌زنيم. در صورت جمع‌آوري هاگ‌ها روي لامل ميكروسكوپ، كافيست هاگ‌ها را ما بين دو لامل قرار داده دور تا دور لبه اين دو لامل را با نوار چسب بچسبانيم تا از نفوذ هاگ‌هاي آلاينده، ايمن شود. در صورتي كه در جمع‌آوري و نگهداري هاگ‌ها دقت كافي نشود، محيط كشت هاگ آلوده شده و امكان به دست آوردن يك كشت خالص كاهش مي‌يابد.